Neurosci Bull︱华云峰/韩华团队基于深度学习实现耳蜗毛细胞的高通量三维电镜重构

撰文︱刘静，王圣雄

责编︱王思珍

哺乳动物的听觉感知依赖耳蜗中一类高度特化的上皮细胞—内毛细胞（inner hair cell，IHC）。由声音引起的机械振动，以耳蜗内淋巴液作为媒介，可触发IHC顶部纤毛的摆动，并导致机械门控离子通道的打开，形成动作电位，继而传递到IHC底部，由带状突触（ribbon synapse）介导完成向听觉神经的突触信号传递[1]。近期的研究发现[2-4]，IHC底部拥有20-30个带状突触，其具有异化的形态特征和功能特性，可对不同强度的声音做出响应，在神经编码过程中实现声音强度的分级。而IHC内带状突触的特异性分布对局部的能量代谢造成了巨大的压力：为了保障高速和持续的神经递质释放，线粒体网络需要根据突触的分布有效地分配能量的供给。前期利用光学显微镜和对电镜切片观察[5, 6]，提出了多个可能的线粒体对带状突触的调控假说，但由于受到分辨率或三维重构方法的限制，在细胞尺度上IHC线粒体和带状突触的三维空间组织方式尚不明确。

2021年11月28日，上海交大医学院附属第九人民医院的华云峰团队和中科院自动化研究所的韩华团队合作在《神经科学通报》（Neuroscience Bulletin）上在线发表了题为“Aligned Organization of Synapses and Mitochondria in Auditory Hair Cells”的研究论文，首次实现了基于深度学习的高通量IHC三维电镜重构，发现了小鼠耳蜗中频区由两类具有结构差异的亚型组成，并揭示了带状突触和线粒体的组织方式呈现距离依赖的相关性。刘静、王圣雄、鲁岩和王皓煜为论文共同第一作者，华云峰研究员和韩华研究员为论文共同通讯作者。

以往的许多研究证据表明，内毛细胞（IHC）内部结构和功能呈现区域化分布，带状突触和线粒体在内毛细胞的窝轴侧和柱状细胞侧具有很高的异质性。但是带状突触和线粒体网络在空间上的排布及功能上的关联仍缺乏定量描述。在此，作者结合连续断面扫描电子显微镜成像技术（serial block-face scanning electron microscopy，SBF-SEM）和深度学习技术（deep learning），以大规模、高通量的方式获取了两组CBA/Ca小鼠的电镜数据，实现了小鼠耳蜗内毛细胞中带状突触和线粒体全细胞范围的结构量化。

为了实现大规模数据亚细胞结构的自动化识别，作者基于深度学习技术并结合识别目标的结构特征，分别设计了定制化的算法。根据带状突触的结构特征，作者基于Mask R-CNN设计了一种3D检测网络，首次实现了大规模电镜数据下带状突触的自动识别，识别精度达到95%。对于内毛细胞和线粒体，作者设计了一种基于3D U-Net和3D连接算法的自动化重建流程，识别精度都达到99%以上（图1）。

图1 内毛细胞中线粒体和带状突触的重建结果

（图引自：Liu, et al., Neurosci Bull, 2021）

根据三维重建结果，作者发现交错排列的IHC具有不同的朝向和细胞形态，据此可以将IHC分为两种亚型（图2）。相较于B亚型细胞，A亚型细胞更偏向柱状细胞侧，且细胞体积更大、纵轴更长。

图2 交错排列的内毛细胞

（图引自：Liu, et al., Neurosci Bull, 2021）

进一步研究表明，这两种细胞亚型带状突触的空间分布具有显著差异。A亚型细胞的带状突触大多集中在窝轴侧，相反B亚型细胞的带状突触更集中在柱状细胞侧。作者通过分析单个带状突触的体积，发现A亚型细胞窝轴侧的带状突触体积比柱状细胞侧的显著更大，而B亚型细胞的带状突触体积更为均一，从而证实了两种细胞亚型的带状突触在空间梯度分布上具有差异（图3）。

图3 带状突触的空间梯度分布情况

（图引自：Liu, et al., Neurosci Bull, 2021）

相似地，线粒体网络在A、B两种亚型的IHC中也存在差异。通过分析全细胞范围线粒体的体积，作者发现A亚型细胞的线粒体总体积显著高于B亚型细胞。进一步的区域化分析（即将细胞分为胞核上和胞核下两个区域）揭示了这种线粒体总体积的差异来源于胞核下区域（图4）。

图4 线粒体网络的分布情况

（图引自：Liu, et al., Neurosci Bull, 2021）

为了研究IHC带状突触和线粒体网络空间分布的关系，作者分析了随着线粒体离IHC底部距离的变化，带状突触体积在窝轴侧所占总体的比例与线粒体总体积在窝轴侧占比的相关性将发生怎样的变化。结果显示仅在IHC底部较近范围内，带状突触与线粒体的分布呈强相关，而随着距离的增加，相关性迅速减弱，两者的相关性呈现距离依赖性（图5）。这一结果提示IHC底部局域化的线粒体网络支持了突触信号传递所需的能量供给。

图5 带状突触与局部线粒体的分布相关性分析

（图引自：Liu, et al., Neurosci Bull, 2021）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究结合三维电子显微镜成像技术和深度学习算法，能够大规模、高通量地获取耳蜗电镜图像数据，实现了内毛细胞（IHC）、带状突触及全细胞范围线粒体的自动化重建和定量化分析。定量化的三维结构数据帮助研究者揭示了IHC的分型、细胞内功能域的分区特性及带状突触与线粒体分布相关性的距离依赖性特征。

与此同时，该研究方法今后同样可以应用于类似的感觉接受细胞和神经元类群，如耳前庭毛细胞、视觉系统的光感受器和双极细胞等。

当然，结构学的研究能够给予我们对生理功能的理解和启发，但仍然有待功能学的研究进一步验证这些结论，从而帮助我们真正理解生物结构与功能的关系。

总之，该研究提示，听觉IHC内部带状突触和线粒体网络的空间梯度分布呈现高度的异质性，可能对传递不同强度的声音信号具有重要作用。

原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s12264-021-00801-w

第一作者刘静（左），通讯作者韩华（中），通讯作者华云峰（右）

（照片提供自华云峰实验室）

第一作者刘静博士毕业于中国科学院大学，主要从事基于深度学习的三维显微图像处理技术。中科院自动化所韩华课题组和上海交通大学华云峰课题组联合高薪招聘博士后，研究方向是感官神经环路微观连接图谱的研究

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1.Dallos, P., A.N. Popper, and R.R. Fay, The cochlea. Springer handbook of auditory research. 1996, New York: Springer. xii, 551 p.

2.Merchan-Perez, A. and M.C. Liberman, Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: correlations with spontaneous discharge rate. J Comp Neurol, 1996. 371(2): p. 208-21.

3.Hua, Y., et al., Electron Microscopic Reconstruction of Neural Circuitry in the Cochlea. Cell Rep, 2021. 34(1): p. 108551.

4.Michanski, S., et al., Mapping developmental maturation of inner hair cell ribbon synapses in the apical mouse cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019. 116(13): p. 6415-6424.

5.Wong, H.C., et al., Synaptic mitochondria regulate hair-cell synapse size and function. Elife, 2019. 8.

6.Bullen, A., et al., Association of intracellular and synaptic organization in cochlear inner hair cells revealed by 3D electron microscopy. J Cell Sci, 2015. 128(14): p. 2529-40.

制版︱王思珍

本文完